Cromatografia

Cromatografia

Por Camila Cristina Crosgnac Fracalossi – Técnica em Bioquímica

A cromatografia é um método físico-químico de separação, baseada na migração diferencial dos componentes de uma mistura. Tal migração ocorre devido às interações entre duas fases, a fase móvel (FM) - o solvente que arrasta a amostra pela coluna e é recolhido através de um filtro que evita a entrada de pequenas partículas no sistema; flui entre os poros ou pela superfície da fase estacionária - e a fase estacionária (FE). O mecanismo envolvido nesta migração diferencial depende do tipo da fase móvel e estacionária utilizado.

A cromatografia, além das aplicações de separação, também analisa qualitativa e quantitativamente as substâncias separadas. Possuem uma faixa de aplicação ilimitada, podendo ser usada em moléculas de diferentes tamanhos e quantidades, de modo que tais características da amostra definem o processo específico escolhido.

Classificação ¬>

- pela forma física do sistema:

§ em coluna (cromatografia líquida, cromatografia gasosa, cromatografia supercrítica);

§ planar (centrífuga – Chromathon, cromatografia em camada delgada – CCD, cromatografia em papel – CP).

- pela fase móvel empregada:

§ utilização de gás (cromatografia gasosa – CG, cromatografia gasosa de alta resolução – CGAR);

§ utilização de líquido (cromatografia líquida clássica – CLC, cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE*);

§ utilização de gás pressurizado (cromatografia supercrítica – CSC).

* na CLAE, a FE é formada por partículas menores.

- de acordo com a fase estacionária:

§ líquida;

§ sólida;

§ quimicamente ligadas.

- de acordo com o modo de separação:

§ por adsorção;

§ por partição;

§ por troca iônica;

§ exclusão;

§ absorção.

Cromatografia Planar

A) Cromatografia em papel: técnica de partição líquido-líquido, um deles fixado em suporte sólido imiscível. O solvente deve ser saturado em H2O. Bastante usado na separação de compostos polares e amplamente usado na área da Bioquímica. É um método simples, que não requer instrumentação sofisticada e de baixo custo, ao mesmo tempo que sua utilização é limitada e há poucos reveladores específicos para tal técnica.

B) Cromatografia em camada delgada: técnica de separação líquido-sólido que se dá pela diferença de afinidade entre os componentes da mistura na FE. Aplica-se principalmente no acompanhamento de substâncias orgânicas, na purificação de substâncias e em sua identificação.

FE mais utilizada: sílica gel, mas também pode ser feita de alumina, terra diatomácea ou celulose.

FM mais utilizada*: geralmente é muito polar, sendo as melhores as misturas de solventes.

* envolve-se o conceito de capilaridade, ou seja, o solvente arrasta mais os componentes menos adsorvidos na FE.

↑ sensibilidade, ↑ velocidade, ↑ repetibilidade, ↓ difusão, ↑ faixa de aplicação, existência de reveladores reativos, permite aquecimento, degradação de compostos lábeis devido à grande superfície de exposição e dificuldades na quantificação.

Reveladores são utilizados na cromatografia planar através de métodos não-destrutivos, como em placas de FE fluorescente (luz UV) ou na presença de cristais de iodo em uma câmara que passa a apresentar pontos marrons.

Cromatografia em Coluna

1) Líquida (FM)

A) Cromatografia Líquida Clássica: bastante utilizada no isolamento de produtos naturais e na purificação de produtos de reações químicas. Os líquidos são separados por adsorção, enquanto os sólidos são separados por partição. A fase móvel passa diversas vezes pela coluna.

FE mais utilizadas: sílica e alumina.

B) Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE): suas colunas apresentam partículas pequenas. Possuem uma bomba de alta pressão para a eluição (passagem) da FM.

FM: alto grau de pureza e livres de O2, não podendo ocorrer oxidação. Deve ser, ainda, filtrada.

Coluna: aço inox.

Detector: o mais utilizado é o UV, com grande número de FE, por absorção. Funciona com anéis aromáticos.

Aplicações: isolamento de produtos naturais e sintéticos e análise de pesticidas, bem como no controle de medicamentos.

FE: pode ser normal (polar – FE mais polar que a FM) ou reversa (apolar).

2) Gasosa (FM – gás de arraste)

Utiliza-se de colunas empacotadas ou capilares. Seu principal mecanismo é baseado na partição dos componentes entre FM (gás) e FE (líquida) – coluna capilar. É uma das técnicas mais utilizadas devido ao seu alto poder de resolução. Há, no entanto, a necessidade de que a amostra seja volátil e termicamente estável, sem apresentar caráter iônico.

A cromatografia gasosa de alta resolução, por sua vez, apresenta coluna de menor diâmetro e, portanto, mais eficiente. Sua FE é líquida, em forma de filme aplicado nas paredes da coluna.

Os gases da FM devem ter alta pureza e ser inertes à FE.

Detectores: ionização em chama (detector simples, bastante sensível e com larga faixa de resposta linear) e condutibilidade térmica (sinal referente à diferença de condutividade térmica do gás de arraste e do gás amostra).

- A acrescentar:

Cromatografia isocrática: ocorre à mesma temperatura.

Cromatografia gradiente: ocorre mudança gradativa da temperatura.